Anticuerpos anti-FVIII: su evaluación por citometría de flujo / Anti FVIII antibodies: evaluation by flow cytometry

En este trabajo se describe un sistema para evaluar y caracterizar los anticuerpos anti-FVIII en pacientes con Hemofilia A Severa (HAS) que reciben el Factor como tratamiento de sustitución. Consiste en el empleo combinado de microesferas y Citometria de Flujo (CF). El rFVIII fue acoplado a microesferas de 2 µm de diámetro (m-FVIII) las cuales se incubaron con diluciones de plasma o suero de pacientes con (n=13) o sin (n=17) inhibidor, pacientes en Tratamiento Inmunotolerante (TIT)(n=5) y dadores normales (N) (n=12). Los anticuerpos se revelaron con anti-lgG humana, anti-lgG1, anti-lgG2, anti-IgG3 o anti-lgG4 biotiniladas, seguido por streptavidina-ficoeritrina. Se registraron los valores de Intensidad de Fluorescencia Media (IFM). Microesferas sin FVIII (m-Control) se utilizaron como control. El resultado se expresó como índice: (IFM de m-FVIII/IFM de m-Control) multiplicado por la inversa de la dilución de máxima respuesta. Se determinó el porcentaje de contribución de cada subclase de IgG. Los resultados presentaron un 86 por ciento de concordancia con la prueba de Bethesda y un 80 por ciento con ELISA. El método fue útil para el seguimiento de los pacientes durante el TIT. La IgG4 prevaleció en pacientes con alto título y al comienzo del TIT. La CF es fácil y rápida y requiere sólo 200 µl de muestra.

In this study, a Flow Cytometry (FC) system is described for detecting and characterizing antibodies (inhibitors) to Factor VIII (FVIII) in Severe Haemophilia A (SHA) patients following FVIII infusion. A combination of microspheres and Flow Cytometry (FC) was employed. First, rFVIII was coupled to microspheres of 2 µm of diameter (m-FVIII). Then, they were reacted with dilutions of plasma or serum of patients with (n=13) or without (n=17) inhibitors. Five patients receiving Immunotolerant Treatment (ITI) and 12 normal donors were included. Microspheres without rFVIII were used as control (m-Control). Captured anti-FVIII antibodies were detected using biotinylated anti-Human IgG, IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 followed by streptavidin-phycoerythrin. FC analysis was performed recording Mean Fluorescence Intensity (MFI). Results were given as an Index: the highest MFI ratio between m-FVIII and m-Control multiplied by the inverse of the corresponding plasma dilution. The contribution of each IgG subclass was expressed as percentage. FC results had 86 per cent and 80 per cent of coincidence with the Bethesda method and ELISA respectively. The test was useful to measure anti-FVIII antibodies during the ITI. IgG4 was the prevalent IgG subclass in patients with high level of inhibitors and previously to ITI. FC was easy, fast and requires only 200 µl of sample.

Linfomas asociados con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana: subtipos histológicos y asociación con los virus de Epstein Barr y Herpes-8 / AIDS related lymphomas: Histopathological subtypes and association with Epstein Barr virus and Human Herpes virus type-8

Los linfomas no Hodgkin (LNH) constituyen la segunda neoplasia definitoria de Sida más frecuente. En el presente trabajo se evaluaron 48 casos de linfomas asociados con la enfermedad debida al virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) diagnosticados en la División Histopatología del Instituto de Investigaciones Hematológicas de la Academia Nacional de Medicina. Se incluyeron en la investigación 5 mujeres y 43 hombres con una mediana de edad al momento del diagnóstico de la neoplasia de 37 años. La evaluación morfológica se realizó en cortes coloreados con hematoxilina-eosina, estudio inmunohistoquímico para la detección del virus de Epstein Barr (VEB) en 48/48 casos, y mediante sonda oligonucleotídica biotinilada para la detección del ADN del Herpes virus humano tipo-8 (HHV-8) en 14/14 linfomas plasmoblásticos (LP). Todos fueron linfomas de fenotipo B, con un curso clínico agresivo y enfermedad neoplásica avanzada al momento del diagnóstico. Se pudo demostrar la fuerte asociación del VEB con los linfomas asociados al sida, con frecuencias que variaron según el subtipo histológico: 16/21 (76%) para los linfomas difusos de grandes células; 1/3 casos (33%) de linfomas de Burkitt y 3/4 (75%) en los linfomas primarios del sistema nervioso central. Globalmente, el genoma del VEB se detectó en 20/28 (71%) de las muestras de biopsias de LNH de esta serie. La detección del HHV-8 resultó negativa en los 14 LP. Los linfomas de Hodgkin fueron más frecuentes en varones,18/20 (90%), con un curso clínico agresivo y franco predominio de los subtipos histológicos de peor pronóstico (90% de casos). En estas neoplasias también se comprobó una frecuente asociación patogénica con el VEB (90% de casos).

Non-Hodgkin lymphomas (NHL) of the B-cell type are the second most common neoplasm among patients with human immunodeficiency virus (HIV) infection and AIDS. Here, we evaluated 48 cases of AIDS-related lymphomas (ARL) diagnosed at the Histopathological Division of the Instituto de Investigaciones Hematológicas of the National Academy of Medicine. Five were females and 43 were males with a median of age of 37 years at the time of the diagnosis. Micrometer sections were prepared and stained with hematoxilin-eosin; immunohistochemical examination for the presence of Epstein-Barr virus (EBV) was carried out in 48/48 cases. Additionally, biotinilated oligonucleotides were used to determine the presence of DNA of the Human Herpes virus type-8 (HHV-8) in 14/14 biopsy smears corresponding to plasmablastic lymphomas (PL). All were fenotype B cell lymphomas with an aggressive course and advanced neoplasm disease at the time of diagnosis. Virological findings showed the strong association between EBV and AIDS-related NHL. According to the histopathological subtype, the EBV genome was detected in 16/21 (76%) diffuse large B cell lymphomas, 1/3 Burkitt lymphoma and 3/4 (75%) of primary central nervous system lymphomas. Globally, EBV genome was detected in 20/28 NHL of this series. Detection of HHV-8 was negative in all cases of PL. Hodgkin lymphoma were more frequent in males 18/20 (90%), with an aggressive clinical course and a significant predominance of the subtypes associated with worse prognosis (90% of cases). We detected a significant association between EBV and HL (90% of cases). We consider that all cases of AIDS related lymphomas should be assessed for the presence of EBV because its presence may play a role in the prognosis.

Diagnosis and treatment of congenital hemophilia with inhibitors: A Latin American perspective / Diagnóstico y tratamiento de la hemofilia congénita con inhibidores: Una perspectiva latinomericana

The Committee of Latin America on the Therapeutics of Inhibitor Groups (CLOTTING) is composed of a number of hemophilia specialists from Latin America. The group aims to encourage the adoption of a good standard of care for Latin American patients with hemophilia. The occurrence of inhibitors in patients with hemophilia poses clinical challenges, and it is estimated that between 1000 and 3 000 patients in Latin America are affected by hemophilia with inhibitors. There is an urgent need to establish a regional consensus and clinical guidelines for the diagnosis and treatment of these patients. We present an extensive review based on best current clinical practice and published literature, as seen from a Latin American perspective, taking into account the variable nature of hemophilia care available in the various countries in this Region.

El Comité Latinoamericano sobre la Terapéutica de Personas con Inhibidores (CLOTTING) está compuesto por un grupo de especialistas en hemofilia de Latinoamérica. El objetivo del grupo es promover la adopción de un estándar de tratamiento óptimo para los pacientes con hemofilia en Latinoamérica. La prevalencia de inhibidores en pacientes con hemofilia en Latinoamérica determina desafíos clínicos y se estima que de 1000 a 3000 pacientes en esta región están afectados con hemofilia e inhibidores. Existe una necesidad urgente de establecer un consenso regional y guías clínicas para el diagnóstico y tratamiento de estos pacientes. Nosotros presentamos una revisión exhaustiva basada en las mejores prácticas clínicas vigentes y en los datos publicados en la literatura, con una perspectiva latinoamericana, tomando en cuenta la variabilidad existente de los tratamientos de la hemofilia disponibles en los diferentes países de esta Región.

Genética de la hemofilia humana. Diagnóstico molecular de defectos en los genes de los factores VIII y IX de coagulación / Genetics of human haemophilia. Molecular diagnosis of defects affecting coagulation factors VIII and IX

La hemofilia A (HA) y B (HB) son enfermedades hemorrágicas hereditarias ligadas al sexo causadas por defectos de los factores VIII y IX, respectivamente. Excepto grandes inversiones recurrentes involucradas en la mitad de las HA severas, el resto de las hemofilias son causadas por distintos tipos de mutaciones grandes y pequeñas. Fueron estudiadas 70 familias con HA severa (se), 6 con seHB, 1 con HA moderada-leve (m) y 2 con mHB. Primero, en seHA, se estudio la inversión del intrón 22 (Inv22) usando un nuevo abordaje basado en PCR inversa. En los casos negativos para las inversiones se estudiaron primariamente las grandes deleciones y secundariamente las mutaciones pequeñas. En familias con HA, encontramos la Inv22 en 43 por ciento de las seHAs, una única inversión del intrón 1, 10 grandes deleciones (catorce por ciento)y 23 mutaciones pequeñas (incluyendo 10 deleciones, 3 inserciones, 4 cambios nonsense, 5 missense y 1 de splicing); y en HB, 1 deleción afectando un sitio de splicing, 4 missense y 3 nonsense. Este esquema de caracterización de mutaciones permite un estudio y análisis molecular preciso de HA y HB y beneficiará tanto al asesoramiento genético como a la provisión de información clave para el diseño del tratamiento.

Prevalencia de infección por virus de hepatitis G en una cohorte de pacientes hemofílicos HIV+ / [Prevalence of hepatitis G virus infection in a cohort of hemophilic HIV positive patients]

We analysed the prevalence of hepatitis G virus (HGV) infection in HCV+/HIV+ hemophilic patients determining HGV viremia in plasma by polymerase chain reaction (PCR). The overall prevalence of HGV infection was 13.51

. Viremia by HGV was more frequent in younger patients. Two subgroups of patients were considered taking into account prognosis of HIV disease progression. The prevalence of HGV infection was significantly higher in those with better prognosis and low risk of evolution to AIDS. The results suggest that HGV infection may slow disease progression, directly or indirectly.

Linfoma no Hodgkin extranodal con localización en cavidad bucal y testículo / Extranodal non-Hodgkin lymphoma with oral cavity and testicular locations

La variedad de patologías existentes en el campo de la hematología que presentan manifestaciones orales pueden inducir a errores en el diagnóstico. En esta oportunidad presentamos un caso infrecuente de un paciente con linfoma no Hodgkin extranodal, con manifestaciones en cavidad bucal y testículo

Carga viral en liquido cefalorraquideo de pacientes hemofílicos HIV-1 positivos bajo tratamiento con HAART / Cerebrospinal fluid viral load in HIV-1 positive hemophilic patients treated with HAART

As HIV seropositive patients with undetectable CSF viral load have a lower likelihood of developing neurologic disease, the determination of CSF viral load levels may be useful to evaluate the efficacy of HAART. We compared plasma viral load levels with HIV-1 RNA CSF levels in 18 hemophilic patients without neurocognitive involvement under HAART. We detected a significant correlation between plasma viral load levels and CSF viral load levels. Fourteen patients with undetectable plasma viral load had undetectable RNA HIV-1 CSF levels as well. Four patients with detectable plasma viral load had detectable HIV-RNA in CSF, but the latter were significantly lower. Viral load is usually lower in non-blood fluids and HAART decreases the viral load in CSF as well as in blood.

Utilidad de la detección de anticuerpos anti-factor VIII por Elisa en hemofílicos / Usefulness of detection of afVIII antibodies by Elisa in haemophiliacs

Los hemofílicos pueden desarrollar en forma concomitante inhibidor lúpico (LA) e inhibidor neutralizante anti-factor VIII (a-fVIII). El diagnóstico diferencial es complejo ya que el LA interfiere en la identificación de los a-fVIII. A fin de detectar a-fVIII sin interferencia de LA, desarrollamos un ELISA utilizando fVIII recombinante libre de fosfolípidos como antígeno con la muestra y revelamos la IgG unidad mediante un anticuerpo anti-IgG humana-fosfatasa. El sistema permitió detectar un anticuerpo monoclonal a-fVIII al ser revelado con el antisuero anti-IgG ratón. Como control inespecífico se utlizaron anticuerpos monoclonales anti-GPIIIa y anti-factor von Willebrand. Para evaluar la utilidad del ELISA, se analizaron plasmas de pacientes hemofílicos con a-fVIII, con o sin LA y hemofílicos sin inhibidor. Como controles negativos se incluyeron plasmas con LA y normales. Los plasmas de hemofílicos con a-fVIII dieron valores de absorbancia >X Normalñ3DE; algunos plasmas hemofílicos sin inhibidor también mostraron absorbancias superiores al normal, aunque inferiores a las observadas para a-fVIII. Las lecturas de los controles no fueron significativas. No observamos interferencias por la presencia de LA. El ELISA a-fVIII sería un elemento diagnóstico complementario, al permitir evidenciar anticuerpos capaces de unirse al fVIII, aún en plasmas LA.

Concurrencia de marcacion citoquimica e inmune de diferentes linajes celulares en casos de leucemias agudas / Concurrence of cytochemical and immune patterns of different cellular lineages in cases of acute leukemia

Se registra la sinonimia entre leucemia mixta, bilineal, biclonal e híbrida, diferenciándola de leucemia bifenotípica. Se define leucemia aguda mixta (LA mixta) como aquella en la que coexistem 1) dos caracteres citoquímicos de línea diferente, o 2) uno de ellos y más de uno inmunológico opuesto, o 3) más de uno inmunológico opuesto a otra línea inmune. Se aportan 7 casos (5 de LA mixta común y 2 de viraje postratamiento). Se concluye que el carácter mixto de una leucemia aguda empeora el pronóstico y se discute la selección de la terapêutica.

Inhibidor neutralizante e inhibidor lúpico en hemofilia: un nuevo problema diagnóstico / Anti-factor VIII inhibitors and lupus anticoagulants in hemophilia: a diagnostic problem

Los hemofílicos pueden desarrollar inhibidores neutralizantes (a-ŸVIII) y/o inhibidores lúpicos (IL). Durante 1993-1994, evaluamos 170 hemofílicos. Aquellos cuyo tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) no corregía con plasma normal fueron reestudiados. En 43 pacientes (25 por ciento) se confirmó el inhibidor, realizándose a continuación: TTPA de la mezcla (1:1) luego de 1 h de incubación a 37§C; prueba con veneno de víbora Russell diluido (dRVVT), corrección (1:1) con normal y neutralización con plaquetas. El IL fue asignado en base a los resultados del dRVVT y el a-ŸVIII al detectarse efecto neutralizante contra ŸVIII e IL negativo. Siete (16 por ciento) pacientes presentaron a-ŸVIII e IL (-) (A). Los 36 (84 por ciento) restantes fueron IL (+); el efecto inhibitorio potenció con la incubación en 12 (B), fue leve en 6 (C) y negativo en 18 (D). Los antecedentes de a-ŸVIII fueron positivos en A:6/6, B:9/11, C:1/6 y D:9/17. La prevalencia de a-ŸVIII fue bajo (4 por ciento) y alto (50 por ciento) el porcentaje de IL tiempo dependiente. Estos resultados sugieren la coexistencia de a-ŸVIII con IL, o su desaparición. Se hace pues necesario el desarrollo de pruebas específicas que permitan identificar a-ŸVIII en presencia de IL.

Apoptosis linfocitaria y evolución clínica en pacientes con hemofilia hiv positivos / Apoptossis and clinical evolution in HIV positive hemophilic patients

Se han postulado diversas hipótesis para explicar los defectos cuali y cuantitativos de los linfocitos T CD4+, en los pacientes HIV+. Ultimamente se ha sugerido que la apoptosis podría estar involucrada en la depleción linfocitaria observada, ya sea por acción del virus o por acción secundaria a la estimulación antigénica. El objetivo de nuestro trabajo fue determinar el IA en HeHIV+ sintomáticos. Se estudiaron 32 HeHIV+ agrupados según la clasificación del CDC en HI, IVA y IVCI. Se evaluaron morfológicamente los linfocitos periféricos en cultivos de 48 horas estimulados o no con anti-CD3. La apoptosis se valoró por medio de coloración, con naranja acridina y bromuro fr etidio. En todos los grupos de HeHIV+ el IA se encontraba muy elevado en los cultivos sin estimular, con respecto a los normales (p<0,001); tambiéen eran significativamente mayor en los HeHIV+ del grupo CDC IVCI con respecto al grupo CDC HI. Por los resultados obtenidos se comprobaría que en los HeHIV+ sintomáticos la estimulacín in vitro produce apoptosis en un porcentaje elevado de los linfocitos circulantes. El IA sería de utilidad en el seguimiento de los pacientes por su relación con el cuadro clínico

Actividad citotóxica "Natural Killer" en pacientes con hemofilia / Natural Killer cytotoxic activity in hemophilic patients

This work attempats to clarify the mechanisms to functional impairment of natural killer activity in individuals with acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and those at high risk of developing AIDS (R-AIDS). We examined the effect pf lymphokine rich supernatants (SN) on effector cells from these individuals. Mononuclear cells (CM) from R-AIDS were more susceptible to stimulation with these SN. When we studied the role of different T lymphocytes subsets in the regulation of NK activity, the results indicate that the effect of SN was the combination of opposite effects. We also studied the ability of CM from patients with Hemophilia (He) to incresase NK cytotoxicity upon stimulation with physiological and non physiological agents (IL-2,IFNa and y, Poly I:Cor PMA). The response was impaired in HIV+, especially in HIV+ with symptoms. Our results also demonstrate that NK cells with slight lytic activity (Leu7 + CD16 -) predominated in HIV+. On the other hand, the ocurrence of IL-2 receptor positive cells was similarly high in both HIV+and HIV- individuals compared to N controls. Analysis of NK activity in several individuals studied after a 2-year period revealed that this function was deteriorated with disease progression. The effect of positive or negative sera for the HIV from. He on normal NK activity was analyzed. We showd that sera from He interfered with normal NK activity. The inhibitory effect found, was higher in HIV+ sera and increased as HIV disease progressed. When the same concentration of DEAE-purified IgG was used, we found that HIV+ AIDS IgG was more inhibitory than the others

Prevalence of HIV antibodies in hemophiliacs in Buenos Aires

Se estudiaron, entre junio de 1984 y marzo de 1987, 237 pacientes con hemofilia hallándose una prevalencia de anticuerpos para el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) del 54%. De ellos, 188 enfermos hemofílicos (156 hemofilia A y 22 hemofilia B) pudieron ser estudiados en detalle; el 54% de los receptores de factor VIII y el 59% de los de factor IX presentaron anticuerpos para HIV; en ambos grupos, la seropositividad estaba asociada a la severidad de la hemofilia. Se observó, además, que 89 de 102 (87%) pacientes hemofílicos sintomáticos presentaron anticuerpos para HIV, comparado con 9 de 26 (12%) pacientes asintomáticos. Se estudiaron 12 mujeres con contactos sexuales con pacientes hemofílicos seropositivos para HIV; en 3 (25%) de ellas se hallaron anticuerpos para el virus y una de ellas presenta linfoadenopatía y pérdida de peso. Nuestros resultados permiten inferir que un alto porcentaje de los hemofílicos estudiados, tratados con Factor VIII y Factor IX antes de 1985, presentan anticuerpos para el virus y que esta seropositividad está asociada a sintomatología y al número de transfusiones recibidas

Presencia de anti-HIV y su relación con parametros inmunológicos y clínicos en pacientes hemofilicos / Presence of anti-HIV and its relation with immunologic and clinic parameters in hemophilics patients

99 pacientes con hemofilia (88 hemofilia A y 11 hemofilia B), fueron estudiados para evaluar su riesgo para contraer el SIDA. Todos los pacientes recibieron tratamiento con concentrado de globulina antihemofílica (GAH) de diferentes orígenes comerciales o con crioprecipitado preparado en el Instituto. Nuestros resultados indican que la exposición a GAH en los últimos cinco años fue significativamente mayor entre los pacientes del Grupo I que en los del Grupo II (p < 0,001), la actividad AntiHIV fue hallada más frecuentemente con síntomas ARC (86% de los pacientes del Grupo I, 12% de los pacientes del Grupo II, p<0,001), el aumento del nivel de los CIC e Ig fue mayor en el Grupo I que en el Grupo II (p < 0,05). Además el 73% de los pacientes pertenecientes al Grupo I tenían valores de Leu 3a significativamente menores, mientras que solamente 24% de los pacientes del Grupo II tenían valores de Leu 3a por debajo del rango normal. Nuestros resultados indican que en la Argentina las características de los pacientes hemofílicos con ARC, son similares a los de otros países del mundo

Citotoxicidad inducida por el suero de pacientes con SIDA y alto riesgo de SIDA (SAR) contra células infectadas por el virus de Epstein-Barr / Cytotoxicity induced by serum of patients with AIDS and high risk of AIDS against infected cells by Epstein-Barr virus

En el suero de pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y sujetos de alto riesgo de SIDA (SAR), se estudió la relación entre la actividad de anticuerpos anti-VCA, la presencia de complejos inmunes circulantes (CIC) y la capacidad de inducir la citotoxicidad dependiente de anticuerpo (CDA) de linfocitos normales contra líneas celulares infectadas con EBV. Se observó que los sueros de estos pacientes indujeron la CDA de linfocitos mononucleares (LM) normales contra células linfoblastoideas infectadas con EBV (P3HRIK y Raji). El título de anti-VCA en los pacientes con SIDA y SAR no difirió del grupo control normal. El contenido de IgG sérica y el nivel de CIC precipitable con PEG-PEG-pp) fue superior al normal. No se encontró relación entre PEG-pp y el nivel de CIC determinado por fijación de C1q (C1q-F). La CDA está favorecida por la presencia de CIC que actúan como puente entre receptores Fc (RFc) de las células P3HRIK y Raji y los LM efectores. De esta manera factores presentes en el suero de pacientes con SIDA y SAR pueden cooperar con LM normales no sensibilizados en la destrucción de células infectadas por EBV a través de la CDA clásica y la CDA mediada por los puentes RFc-RFc